脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxidation，LPO）含量試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

注　意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

脂質(zhì)過氧化是動(dòng)植物體內(nèi)活性氧(ROS)氧化生物膜的過程，脂質(zhì)過氧化物（LPO）是脂質(zhì)過氧化過程的產(chǎn)物，即 ROS 與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成 LPO，使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。因此，LPO 常被作為機(jī)體氧化應(yīng)激的一種指標(biāo)，與某些疾病的病理過程，如腫瘤、化學(xué)中毒、感染、炎 癥、自身免疫疾病、動(dòng)脈粥樣硬化（AS）及心腦血管疾病，以及衰老等生理過程密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

LPO 在酸性條件下加熱，產(chǎn)生小分子終產(chǎn)物 MDA，MDA 與硫代巴bi妥酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，在 535nm 有最大吸收峰。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配置：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 35mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 12mL×1 瓶，4℃保存。

注意事項(xiàng)：

臨用前注意試劑二是否wan全溶解，如未溶解，可以 70℃-90℃加熱，并振蕩以促進(jìn)溶解。

LPO 提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 535 nm。

2、在 EP 管中依次加入如下試劑

立即混勻，95℃水浴 40min 后，流水冷卻。3000g 離心 10min，吸取 200µL 上清加入 96 孔板，測(cè)定 535nm 下各管吸光值，記作 A 測(cè)定和 A 空白。ΔA=A 測(cè)定-A 空白。

　　LPO 含量計(jì)算：

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

y = 0.5723x - 0.0076，R² = 0.9997，x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度 μmol/mL，y 為吸光度。

1、血清（漿）中 LPO 含量的計(jì)算：

LPO 含量(nmol/ mL)=（ΔA+0.0076）÷0.5723×V 標(biāo)÷V 樣×1000 =1747.3×（ΔA+0.0076）

2、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中 LPO 含量計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

LPO 含量(nmol/ mg prot)=（ΔA+0.0076）÷0.5723×V 標(biāo)÷(Cpr×V 樣)×1000 =1747.3×（ΔA+0.0076）÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

LPO 含量(nmol/g 鮮重)=（ΔA+0.0076）÷0.5723×V 標(biāo)÷(W ×V 樣÷V 樣總)×1000 =1747.3×（ΔA+0.0076）÷W

(3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

LPO 含量(nmol/10⁴)=（ΔA+0.0076）÷0.5723×V 標(biāo)÷(500×V 樣÷V 樣總)×1000

=3.495×（ΔA+0.0076）

V 標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)曲線中加入標(biāo)品體積，0.03mL；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬；1000，μmol 到 nmol 換算系數(shù)。