谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100管/48樣

注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

GPT（EC 2.6.1.2）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化氨基酸和酮酸轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，在氨基酸代謝中具有重要作用。此外，哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞GPT活性很高，當(dāng)肝細(xì)胞壞死，GPT釋放到血液中，血清GPT活性顯著增高。因此，GPT被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)。

測(cè)定原理

GPT催化丙氨酸和α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成丙酮酸和谷氨酸；加入2,4-er硝基苯肼溶液，不僅終止上述反應(yīng)，而且與酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在堿性條件下呈紅棕色，可以在505nm讀取吸光值并計(jì)算酶活力。

試驗(yàn)中所需的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：60mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體2.5 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：液體2.5 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑三：液體25 mL×1瓶，4℃保存；

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   在EP管或在96孔板中加入下列試劑

混勻后，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)20min

混勻后，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)20min

混勻，室溫（25℃）放置10min，在505nm波長(zhǎng)處測(cè)各管吸光度A。ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線， y = 0.4228x+0.0003   (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y為ΔA)。

2、血清（漿）GPT活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0003）÷0.4228÷T×10³=118.26×（ΔA-0.0003）

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中GPT活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =118.26×（ΔA-0.0003）÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =118.26×（ΔA-0.0003）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/10⁴ cell）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³ =0.236×（ΔA-0.0003）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線， y = 0.2114x+0.0003   (x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，umol/mL；y為ΔA)。

2、血清（漿）GPT活力的計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0003）÷0.2114÷T×10³=236.5×（ΔA-0.0003）

3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中GPT活力的計(jì)算

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0003）÷0.2114×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =236.5×（ΔA-0.0003）÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA-0.0003）÷0.2114×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =236.5×（ΔA-0.0003）÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GPT（nmol/min/10⁴ cell）=[（ΔA-0.0003）÷0.2114×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³ =0.473×（ΔA-0.0003）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20 min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)；10³：1umol/mL=10³ nmol/mL。

1、   標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：0.01 umol/mL -2 umol/mL。

2、   ΔA線性范圍為：0.01 -1。