谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                       微量法 100管/48樣

注   意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不僅可以防止過(guò)多的銨離子對(duì)生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲(chǔ)存和運(yùn)輸形式。

測(cè)定原理：

GS在ATP和Mg²⁺存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ─谷氨?；惲u肟酸，在酸性條件下與鐵形成的絡(luò)合物在540nm處有最大吸收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。

所需的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：10mL×1瓶，-20℃保存；臨用前37℃預(yù)熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。

試劑二：10mL×1瓶，-20℃保存；臨用前37℃預(yù)熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。

試劑三：粉劑×2瓶，-20℃保存。用時(shí)每瓶加入5mL蒸餾水充分溶解待用。

試劑四：15mL×1瓶，4℃保存。

樣本測(cè)定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   在EP管中加入下列試劑：

  混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）準(zhǔn)確水浴30min

混勻，25℃室溫靜置10min后，8000g，25℃離心10min，取200μL上清液至微量石英比色皿或96孔板中，測(cè)定540nm處的吸光值A。△A=A測(cè)定管-A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

GS活力單位的計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.8348x + 0.0008，R² = 0.9999

1、血清（漿）GS活性

單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

計(jì)算公式：

GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷V樣÷T

=10.268×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞GS活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=10.268×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GS（μmol/h/g 鮮重）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T

 =10.268×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GS（μmol/h//10⁴ cell）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.021×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL； V樣：加入樣本體積，0.07mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.4174x + 0.0008，R² = 0.9999

1、血清（漿）GS活性

單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

計(jì)算公式：

GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷V樣÷T

=20.535×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞GS活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=20.535×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GS（μmol/h/g 鮮重）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T

 =20.535×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每小時(shí)產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個(gè)酶活力單位。

GS（μmol/h/10⁴ cell）=(ΔA-0.0008)÷0.4174×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷T

 =0.041×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL； V樣：加入樣本體積，0.07mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。