綠膿假單胞菌探針法熒光定量PCR試劑盒

產(chǎn)品名稱：綠膿假單胞菌探針法熒光定量PCR試劑盒

英文名稱：Pseudomonas aeruginosa Probe qPCR Kit

綠膿假單胞菌又稱銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），1882 年首先由 Gersard 從傷口膿液中分離到，是一種革蘭氏陰性菌、好氧、呈長(zhǎng)棒形的細(xì)菌，只有單向的運(yùn)動(dòng)性。它是一種機(jī)會(huì)性感染細(xì)菌，且對(duì)植物亦是機(jī)會(huì) 性感染的，感染后因膿汁和滲出液等病料呈綠色，故名。廣泛分布于自然界及 正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌之一，因此快速檢測(cè)綠膿假單胞菌具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)綠膿假單胞菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.    即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.    引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3.    提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.    特異性高，引物是根據(jù)綠膿假單胞菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病原菌

DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.    本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

【試劑組成】

【運(yùn)輸及保存】

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

【自備試劑】

樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。

由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，

2.    下同）。

在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震

蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.    換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.    換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.   重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.    如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性

對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8.    用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA/提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.    如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.    在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好

后最后加）：

四、數(shù)據(jù)處理

12.  如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13.  如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。