猴痘病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：猴痘病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Monkey Pox Virus(MPV) SYBR qPCR Kit

猴痘病毒(Monkey Pox Virus，MPV)會引起猴痘，是一種罕見的病毒性疾病,主要發(fā)生于中部與西部非洲熱帶雨林國家。該病于1958年首ci在丹麥哥本哈根一實驗室綠猴中發(fā)現(xiàn),可引起實驗用靈長類動物發(fā)病,許多非洲嚙齒動物也都有猴痘病毒感染。該病毒也可感染小鼠、大鼠和兔。1970年剛果首ci報告猴痘病毒感染人類的病例。該病毒對人和動物健康造成較大損害，因此猴痘病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的猴痘病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，它具有下列特點：

1.       即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2.      根據(jù)猴痘病毒保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。

3.      靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。

4.      一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。

5.      本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。

6.      本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

【試劑組成】

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年

【自備試劑】

DNA模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。

【使用方法】

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA

1.       片段作為陽性對照。

2.      標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3.      用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4.      在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5.      換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6.      換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7.      重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8.       如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?span>10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9.      用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA/提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10.      如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11.      在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。

12.       蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

13.       數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時，最大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時的最大吸收光譜在500 nm，最大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14.       如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

      15.       如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。