小鼠磷酸肌醇3激酶(PI3K)ELISA試劑盒

(ELISA) 使用說明書

?    本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中小鼠磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)的含量。

?   有效期：6 個月

? 保存條件：2-8℃

?   小鼠磷酸肌醇3激酶(PI3K)ELISA試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷

實驗原理實驗

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被小鼠磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準品、HRP 標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并che底洗滌。用底物 TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm  波長下測定吸光度（OD  值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1） 血清 操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后 1000

×g 離心 10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2） 血漿 EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g 離心 30 分鐘去除顆粒。

3） 細胞上清液   1000×g 離心 10 分鐘去除顆粒和聚合物。

4） 組織勻漿 將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g 離心 10 分鐘，取上清液

5） 保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在 37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

注：標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑和器材

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.  37℃恒溫箱

4.    蒸餾水或去離子水

試劑盒組成

備注：

1.標(biāo)準品濃度依次為：80、40、20、10、5、2.5 U/L

2.經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取 50μL 樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準品濃度時，可用樣本/稀釋液將標(biāo)本進行適當(dāng)稀釋后再進行實驗。

注意事項

1.      嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫 20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2.      洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3.    消除板底殘留的液體和手指印，否則影響 OD 值。

4.    底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。

5.    避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

6.    在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7.    平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8.      任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

9.    不能使用過期產(chǎn)品。

10.    如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按

1：20 稀釋，即 1 份 20×洗滌緩沖液加 19 份蒸餾水。

操作步驟

1.    從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。

2.    設(shè)置標(biāo)準品孔和樣本孔，標(biāo)準品孔各加不同濃度的標(biāo)準品 50μL；

3.    樣本孔中加入待測樣本 50μL；空白孔不加。

4.    除空白孔外，標(biāo)準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。

5.     棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機洗板）。

6.    每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。

7.    每孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。

實驗結(jié)果計算

以所測標(biāo)準品的 OD 值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的 OD 值代入方程，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1.    檢測范圍：2.5 U/L – 80 U/L。

2.    靈敏度：Z低檢測濃度小于 0.1 U/L。

3.    特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.    重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于 10% ，板間變異系數(shù)小于 15% 。

說明

由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。

1.      最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準備充足的標(biāo)本備份。

2.      不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。

3.      只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。

4.      本公司只對試劑盒本身負責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

5.      使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致

ELISA 實驗結(jié)果偏差。

6.    若樣本為細胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。

7.    某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。