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免RNA提取RT-PCR試劑盒

簡(jiǎn)要描述:免RNA提取RT-PCR試劑盒是一種免 RNA 提取的 RT-PCR 試劑盒,它使用精心優(yōu)化的細(xì)胞裂解液直接裂解培養(yǎng)細(xì)胞,然后直接在細(xì)胞裂解液中進(jìn)行 RT,再用 cDNA 進(jìn)行 PCR 或熒光定量 PCR。

  • 更新時(shí)間:2024-06-28
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 生產(chǎn)地址:上海
  • 訪  問(wèn)  量:948

詳細(xì)介紹

品牌YLKBIO純度詳詢
貨號(hào)YLK10357P規(guī)格50T
供貨周期現(xiàn)貨主要用途科研
應(yīng)用領(lǐng)域化工,生物產(chǎn)業(yè)中文名稱:免RNA提取RT-PCR試劑盒
英文名稱:Cell?Lysate?RT-PCR?Kit運(yùn)輸:低溫運(yùn)輸
保存條件:-20℃有效期:24個(gè)月
自備試劑RT 引物、PCR 引物對(duì)

中文名稱:免RNA提取RT-PCR試劑盒

英文名稱:Cell Lysate RT-PCR Kit

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸,-20℃保存,有效期兩年

自備試劑

RT 引物、PCR 引物對(duì)

規(guī)格及成分

成 分

十孔盒包裝

溶液 A

25 mL

溶液 B

   0.5 mL

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 (含 RI)

100 µL

RT Buffer(含 dNTP)

300 µL

PCR MagicMix 3.0(含染料)

9 mL

RNase-free 水

10 mL

使用手冊(cè)

1 份

使用方法


注意:無(wú) RNase 的環(huán)境和使用無(wú) RNase 污染的試劑是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

強(qiáng)烈建議使用優(yōu)利科的固相 RNase 清除劑去除工作臺(tái)面的 RNase,用氣相

RNase 去除空氣中的 RNase。實(shí)驗(yàn)前需要將 95%乙醇放-70℃預(yù)冷,最好用空槍頭盒盛乙醇。

一、細(xì)胞培養(yǎng)、裂解

1.     按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞、胰/酶消化并計(jì)數(shù)。

2.     轉(zhuǎn)移 1×10E5 個(gè)細(xì)胞到離心管中,400×g 離心 4 分鐘。

3.     吸棄上清(即培養(yǎng)基),保留細(xì)胞沉淀。

4.     用 0.5 mL 溶液 A 重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞濃度調(diào)整到 2×10E5 細(xì)胞/mL。

5.     轉(zhuǎn)移 10 µL 的懸浮細(xì)胞到 0.2 mL PCR 管中,并加入 10 µL 的溶液 B,此時(shí)細(xì)胞終濃度為 10E5 細(xì)胞/mL。

6.     迅速將離心管插入浮子中,放入-70℃預(yù)冷的、95%乙醇中 1-3 分鐘。10 µL 槍頭盒一般能讓 0.2 mL 的 PCR 管一半沒(méi)入到乙醇中。

7.     在室溫的水浴鍋中快速解凍細(xì)胞,渦旋 10 秒后短暫離心數(shù)秒,將管中液體

(細(xì)胞裂解液)轉(zhuǎn)移到新的離心管中,放冰上待用。

二、RT(逆轉(zhuǎn)錄)反應(yīng)合成 cDNA

8.     按下表設(shè)置 RT 反應(yīng)體系20 µL 體系為例):

成分

樣品管

陰性對(duì)照管

細(xì)胞裂解液(含 RNA)

2.5 µL

2.5 µL

RT Buffer(含 dNTP

6 µL

6 µL

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(含 RI)

2 µL

無(wú)

RT 引物(100ng/µL)

1 µL

1 µL

RNase-free 水

補(bǔ)水到 20 µL

補(bǔ)水到 20 µL









9 .     2℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

10.     70保溫 10 分鐘以終止反應(yīng),然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作PCR 模板使用,不需要純化。也可以放置在-20℃長(zhǎng)期保存

三、PCR 方案一(RT 產(chǎn)物全部用于 PCR)

11.     在上步的 RT 反應(yīng)管中直接按下表加入各成分(100 µL 體系為例):

成分

每管加入量

PCR MagicMix 3.0(已加染料

50 µL

自備正向 PCR 引物 (100 ng/µL)

2 µL

RNase-free 水

補(bǔ)水到 100 µL





  12.    直接進(jìn)入第 14 步。

四、PCR 方案二(部分 RT 產(chǎn)物用于 PCR

13.    按下表設(shè)置 PCR 反應(yīng)體系(以 30 µL 體系為例):

成分

每管加入量

PCR MagicMix 3.0(已加染料

15 µL

cDNA 樣品(RT 反應(yīng)產(chǎn)物)

1-5 µL

自備正向 PCR 引物 (100 ng/µL)

1 µL

自備反向 PCR 引物 (100 ng/µL)

1 µL

RNase-free 水

補(bǔ)水到 30 µL

注意:RT 引物可以用做反向 PCR 引物。

14.    PCR 反應(yīng)參數(shù)(需要根據(jù)模板和引物 Tm 值決定,下面的參數(shù)只做參考):

過(guò)程

溫度

時(shí)間

預(yù)變性

94℃

5 min

PCR 反應(yīng)

(35 個(gè)循環(huán))

94℃

1 min

55℃

1 min

72℃

2 min

最后延伸

72℃

10 min

五、電泳檢測(cè)

15.    取 5-10 µL PCR 產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳,跟分子量標(biāo)準(zhǔn)比較估計(jì)出擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。注:本試劑盒中的 PCR mix 含有甘油和染料,可以直接上樣,不需要額外再加電泳上樣液。


免RNA提取RT-PCR試劑盒

特點(diǎn)如下:

1.     免 RNA 提取,從細(xì)胞裂解到 RT-PCR 或?qū)崟r(shí)定量 RT-PCR 結(jié)果只需三個(gè)步驟,省略了整個(gè) RNA 提取過(guò)程。

2.     靈敏度不低于常規(guī)方法(先提總 RNA 再進(jìn)行 RT-PCR),不但可以檢測(cè)到低拷貝的 RNA,還可用于檢測(cè) miRNA。

3.     整合了去除基因組 DNA 的步驟,只檢測(cè) RNA,無(wú)需擔(dān)心基因組 DNA 的污染。

4.     每次只需要 10-100000 個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞或含相應(yīng)細(xì)胞數(shù)的痕量組織(如 LCM 樣品),驗(yàn)證過(guò)的細(xì)胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等,但不能用于 U937 細(xì)胞系。

5.     兩步法 RT-PCR,后續(xù)使用靈活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR,也可用于基于 SYBR 的熒光定量 PCR,也可用于其他定量 PCR(如 TaqMan), 非常靈活。

6.     即適用于少量樣品,也適用于平行處理大量樣品及高通量篩查。

7.     本產(chǎn)品足夠用于 50 次 20µL 體系的 RT 和 600 次 30µL 體系(或約 200 次100µL 體系)的 PCR。

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