【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽類組織滴蟲?。℉istomoniasis）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name ：Histomoniasis Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

禽類組織滴蟲?。℉istomoniasis），又稱盲腸肝炎或黑頭病，是由于火雞組織滴蟲（Histomonas meleagridis）感染雞形目禽類所導致的以肝臟壞死和盲腸腫大為主要臨床特征的寄生蟲病。

本試劑盒適用于檢測分離的蟲體、組織器官、泄殖腔內(nèi)容物等樣本的禽類組織滴蟲病，用于禽類組織滴蟲病   感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對禽類組織滴蟲病特異性引物，結合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術對禽類組織滴蟲病的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

Histomoniasis 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

Histomoniasis 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

采集分離的蟲體、組織器官、泄殖腔內(nèi)容物等樣本。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

分離的蟲體：將培養(yǎng)的含有蟲體的培養(yǎng)液吸取 1.5mL 到滅菌的 EP 管中，然后在 3 000 r/min 離心 5 min，棄去上清液，取沉淀物-20℃凍存，作為待檢樣品；

組織器官：用滅菌眼科剪采集禽類的肝臟或盲腸，每份 100mg，標記后放入 1.5mL 離心管，用眼科剪剪碎組織，勻漿器勻漿，-20℃凍存，作為待檢樣品；

泄殖腔內(nèi)容物：用 1.0mL 以上的注射器，將 2mL 的 40℃滅菌生理鹽水注入禽類泄殖腔，以洗滌泄殖腔，然后將洗滌液收集于 1.5mL 離心管中，以 3 000r/min 離心沉淀 5min 后，棄去上清液，取沉淀物-20℃凍存，作為待檢樣品。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請   按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑Histomoniasis 反應液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結束后自動保存結果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準.NY/T 3463-2019 禽組織滴蟲病診斷技術.