雞白痢/雞傷寒沙門氏菌（SP/SG）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：雞白痢/雞傷寒沙門氏菌（SP/SG）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name ：S.Gallinarum-Pullorum Nucleic Acid Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預(yù)期用途】

由沙門氏菌屬的某些致病性沙門氏菌引起的雞群細(xì)菌性傳染病稱為雞沙門氏菌病，一般分為雞白痢、雞傷寒和副傷寒三種病型，其中以雞白痢和雞傷寒發(fā)病較多，危害較強(qiáng)。雞白痢是由雞白痢沙門氏菌（S.Pullorum）感染雞群引起的，主要是侵害雛雞。2 周以下的雛雞發(fā)病后死亡率可達(dá) 40%-70%，受感染的雛雞在 4-7 天死亡，急性時可在 1-3 天死亡。雞傷寒沙門氏菌（S.Gallinarum）感染雞群可引起雞傷寒病癥，主要是感染成年雞，雛雞有時也會被感染， 出殼后幾天開始發(fā)病， 死亡率較高。 現(xiàn)在， 這兩種致病菌統(tǒng)稱為雞- 雛沙門氏

（S.Gallinarum-Pullorum），沒有鞭毛，不會運(yùn)動，只會感染雞群，可存在于卵巢、睪丸、肝臟等器官中，能夠通過親代感染子代，因此對養(yǎng)雞業(yè)的危害極大。

本試劑盒適用于肝臟、脾臟等組織樣品以及腸內(nèi)容物樣品，糞便樣品，泄殖腔拭子樣品等樣品中的雞白痢/      雞傷寒沙門氏菌，用于雞白痢/雞傷寒沙門氏菌感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計一對雞白痢/雞傷寒沙門氏菌特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對雞白痢/雞傷寒沙門氏菌的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

SP/SG 反應(yīng)液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

SP/SG 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

組織樣品：選擇具有典型臨床癥狀的病死雞，無菌取其肝臟、脾臟等組織樣品，放置于無菌容器內(nèi)，標(biāo)記好   組織名稱和采樣日期，冷藏運(yùn)送到實驗室進(jìn)行檢測。

肛拭子樣品：采集肛拭子樣品時，取無菌棉拭子插入畜禽肛-門或泄殖腔中，旋轉(zhuǎn) 2 圈~3 圈，刮取直腸黏液或糞便，放入裝有 30%甘油磷酸鹽緩沖液或半固體培養(yǎng)基中送檢。

腸內(nèi)容物樣品：取腸內(nèi)容物時，應(yīng)燒烙腸壁表面，用吸管中扎穿腸壁。從腸腔內(nèi)吸取內(nèi)容物放入盛有滅菌的

30%甘油磷酸鹽緩沖液或半固體培養(yǎng)基中送檢或?qū)в屑S便的腸管兩端結(jié)扎，從兩端剪斷送檢。

糞便樣品：應(yīng)選新鮮糞便至少 10g，運(yùn)送糞便樣品可用帶螺帽容器或滅菌塑料袋，不得用帶皮塞的試管。

【保存和運(yùn)輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；水樣便 13000rpm 離心 2min，去盡上清；其它樣品處理參考 NY/T541-2016。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請   按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑SP/SG 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX

參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點(diǎn)擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 40049-2021 雞腸炎沙門氏菌 PCR 檢測方法[S]