γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）試劑盒說明書

                                          微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

γ-GT是γ-谷氨酰循環(huán)中的關鍵酶，催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨?；衔锷系?/span>γ-谷氨?；D移到受體。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，產生谷氨酸鹽，在細胞外谷胱甘肽新陳代謝中起了重要的作用。

測定原理：

γ-GT催化谷氨酰對硝基苯胺中γ-谷氨?；D移給N-甘氨酰甘氨酸，生成對硝基苯胺，在405nm有特征光吸收；通過測定405nm光吸收增加速率，來計算γ-GT酶活性。

自備儀器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、可調節(jié)移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體4mL×1瓶，4℃保存。

試劑四：液體14.8mL×1瓶，4℃保存。

工作液（在試劑二瓶中配制）：臨用前配制，把試劑三倒入試劑二瓶中，充分溶解（室溫過低時可以40℃水浴促進溶解）；然后把試劑四倒入試劑二瓶中，混勻后室溫保存。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。

2.        細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

γ-GT測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節(jié)波長到405 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）水浴中預熱30min（保證無沉淀）。

3. 測定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，依次加入20μL上清液，180μL工作液，混勻后于405nm測定10s和70s時吸光度，記為A1和A2。

γ-GT活性計算：

標準曲線：y=0.006x+0.0016，x為對硝基苯胺濃度，y為吸光值，R²=0.999。

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GT（μmol/min/10⁴ cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1.67 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mL）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.006×V反總÷V樣÷T

= 1.67 × [ (A2－A1)－0.0016]

V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10^-4L；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質量；V樣：反應體系中加入上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間（min），1min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y=0.003x+0.0016，x為對硝基苯胺濃度，y為吸光值，R²=0.999。

 (1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mg prot）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

=3.34× [ (A2－A1)－0.0016] ÷ Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GT（μmol/min/g 鮮重）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GT（μmol/min/10⁴ cell）=[ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=3.34 × [ (A2－A1)－0.0016] ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化產生1μmol對硝基苯胺為1個酶活單位。

γ-GT（μmol/min/mL）= [ (A2－A1)－0.0016]÷0.003×V反總÷V樣÷T

= 3.34 × [ (A2－A1)－0.0016]

V反總：反應體系總體積（L），200μL=2×10^-4L；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W ：樣品質量，g；V樣：反應體系中加入上清液體積（mL），20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間（min），1min。

注意事項：

1.        培養(yǎng)細胞中γ-GT活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細胞中γ-GT的提取時可加試劑一后

2.        研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞（防止因為蛋白質變性導致酶失活）。

3.        配置好的工作液2周內使用完畢。