蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                            微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定管前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

蔗糖不僅是重要的光合產(chǎn)物，也是植物體內(nèi)運(yùn)輸?shù)闹饕镔|(zhì)，還是碳水化合物的貯存形式之一。SPS（EC 2.4.1.14）以果糖-6-磷酸為受體，形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系統(tǒng)看作是蔗糖合成的主要途徑。

測(cè)定原理：

蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸與間苯二酚反應(yīng)可呈現(xiàn)顏色變化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小與顏色的深淺成正比。

需自備的的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰

試劑的組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體2.5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：液體2mL×1瓶，4℃保存

試劑四：液體25mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：液體6mL×1瓶，4℃避光保存；

樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、   分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至480nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測(cè)定，（在EP管中依次加入下列試劑）：

混勻，25℃準(zhǔn)確水浴10min

沸水浴中煮沸10min左右（蓋緊，以防止水分散失），冷卻

混勻，沸水浴30min，冷卻后，取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下測(cè)定各管吸光值。標(biāo)準(zhǔn)管和空白管只要做一管。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

SPS活力單位的計(jì)算：

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SPS活性(μg /min/mg prot)= C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×（A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×（A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

2、按照樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個(gè)酶活力單位。

SPS活性(μg /min/g鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)管×V1×（A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×（A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，1000μg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL； V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；T ：反應(yīng)時(shí)間：10min。