磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法100T/48S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

磷脂酶A2（EC3.1.1.4）是磷脂sn-2位脂酰基水解酶，廣泛存在于動(dòng)植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞核分泌物中，參與脂肪消化，精子成熟、細(xì)胞信號(hào)傳遞、脂質(zhì)過(guò)氧化修復(fù)、宿主反應(yīng)等生理過(guò)程，在控制體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、參與疾病的病理進(jìn)程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。

測(cè)定原理：

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿（HEPC）產(chǎn)生游離巰基，與DTNB反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，在412nm處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、超速冷凍離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體×5瓶，-20℃避光保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加入1.8mL試劑二充分混勻；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣品處理：

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10000g離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

3.        血清：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 73.53×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（×d）×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 73.53×△A÷W

3. 細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/10⁴ cell）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T= 73.53×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/mL）= △A÷（×d）×V反總÷V樣÷T= 73.53×△A

：TNB消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，1mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，10min

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=147.06×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/g 鮮重）= △A÷（×d）×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 147.06×△A÷W

3. 細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/10⁴ cell）= △A÷（×d）×V反總÷（V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）÷T=147.06×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性（nmol/min/mL）= △A÷（×d）×V反總÷V樣÷T= 147.06×△A

：TNB消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，1mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，10min