游離膽固醇（free cholesterol, FC）含量測定試劑盒說明書

                                                  微量法100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

FC是構成細胞膜的主要成分，也是合成腎上腺皮質激素、性激素、膽汁酸及維生素D等生理活性物質的重要原料。FC濃度可作為脂代謝的指標。

測定原理：

FC氧化酶催化FC生成△4-膽甾烯酮和H₂O₂，過氧化物酶催化H₂O₂、4-氨基安替比林和酚生成紅色醌類化合物，在500nm有吸收峰，其顏色深淺與FC含量成正比。

自備儀器和用品：

水浴鍋、可調式移液槍、酶標儀、96孔板、異丙醇和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：異丙醇100mL（自備）；

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑四：液體40μL×1瓶，4℃保存；

TC標準品：液體1mL×1支，0.5μmol/mL，4℃保存。

FC的提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2．細菌、真菌：先收集400-500萬細胞或細菌到離心管內，棄上清，加1mL試劑一，超聲波破碎1min（強度20％，超聲2s，停1s），即FC待測液。

3．血清（漿）樣品：直接測定。

測定操作：

1. 酶標儀預熱30 min，調節(jié)波長到500 nm。

2. FC工作液的配制：臨用前，吸取約0.8mL試劑二分別加入試劑三和試劑四瓶中，充分溶解后再全部轉移回試劑二瓶中，充分混勻，FC工作液置于37℃水浴10min。用不完的工作液4℃保存一周。

3. 標準管：依次在96孔板中加入20μL FC標準液和180μL FC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測定A標準管。

4. 測定管：依次在96孔板中加入20μL FC待測液和180μL FC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測定A測定管。

5、空白管：依次在96孔板中加入20μL 試劑一和180μL FC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測定

A測定管。

注意事項：

1、   標準管和空白管只要做一管。

2、   若測定管產(chǎn)生白色渾濁，可以將待測液用異丙醇稀釋2~5倍后測定，并在最后結果乘以相應倍數(shù)。

計算公式：

1. 血清（漿）中FC含量計算：

FC含量（μmol /dL）= C標準液×（A測定管-A空白管）÷（A標準管-A空白管）×100mL

=50×（A測定管-A空白管）÷（A標準管-A空白管）

C標準液：0.5μmol/mL；100 mL：1dL=100 mL。

2. 組織中FC含量計算：

(1)按樣本蛋白濃度計算

FC含量（μmol / mg prot）= C標準液×（A測定管-A空白管）÷（A標準管-A空白管）÷Cpr

                       = 0.5×（A測定管-A空白管）÷（A標準管-A空白管）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

FC含量（μmol / g 鮮重）= C標準液×（A測定管-A空白管）÷（A標準管-A空白管）÷W

                  = 0.5×（A測定管-A空白管）÷（A標準管-A空白管）÷W

C標準液：0.5μmol/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g/mL

3. 細胞、細菌中FC含量計算：

FC含量（μmol /10⁴ cell）= C標準液×（A測定管-A空白管）÷（A標準管-A空白管）÷細菌或細胞（10⁴ cell /L）

=0.5×（A測定管-A空白管）÷（A標準管-A空白管）÷細菌或細胞（10⁴ cell /L）

C標準液：0.5μmol/mL。

Z低檢出限為1nmol/mL。