NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）試劑盒說明書

                                      微量法 100管/96樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

NOX（EC 1.6.99.3）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，可在氧氣存在下，直接將NADH氧化為NAD。該酶不僅參與NAD的再生，而且與免疫反應密切相關。

測定原理：

NOX能夠將NADH氧化為NAD，NADH的氧化與2,6二氯酚靛藍（DCPIP）的還原相偶聯(lián)，藍色的DCPIP被還原為無色的DCPIP，在600nm下測定藍色DCPIP的還原速率計算出NADH氧化酶活性的大小。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1.5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑四：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入5mL蒸餾水，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①        準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②        將勻漿600g，4℃離心5min。

③        棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。

④        上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的NOX（此步可選做）。

⑤        步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），用于NOX活性測定。

血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、  分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至600nm，蒸餾水調零。

2、  樣本測定

（1）試劑四于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL試劑四和40μL試劑五，混勻，記錄600nm處20s時吸光值A1和 1min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

NOX活力單位的計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）NOX活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2500×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.01定義為一個酶活力單位。

NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.25mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下：

1、血清（漿）NOX活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=5000×ΔA

2、組織、細菌或細胞中NOX活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T=5000×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOX（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T=1010×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A600變化0.005定義為一個酶活力單位。

NOX（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T=2.02×ΔA

V反總：反應體系總體積，0.25mL； V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。