胃蛋白酶（Pepsin）試劑盒說明書

                                              微量法100T/48S

注    意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：                          

胃蛋白酶由胃粘膜主細(xì)胞分泌，分解食物中蛋白質(zhì)成小肽段。一般用于神經(jīng)性低酸癥的鑒別，慢性胃炎、慢性胃擴(kuò)張、慢性十二指腸炎等癥狀時(shí)也會引起胃蛋白酶分泌的減少。

測定原理：

胃蛋白酶可催化血紅蛋白水解，水解產(chǎn)物與福林試劑反應(yīng)后顯藍(lán)色；一定范圍內(nèi)，其顏色的深淺與胃蛋白酶活性呈正比。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加入10mL試劑二充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入10mL蒸餾水充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入15mL蒸餾水充分溶解。

試劑六：液體3.3mL×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1.27mL×1支，0.5μmol/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度4℃保存。

粗酶液提取：

組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

測定步驟：

1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到580 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三和試劑四置于37℃水浴預(yù)熱30min。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取微量玻璃比色皿/96孔板，加入20μL標(biāo)準(zhǔn)品，40μL試劑二，120μL試劑五，20μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板，加入20μL蒸餾水，40μL試劑二，120μL試劑五，20μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于 580 nm測光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)空白管。

5. 對照管：取 EP管，加入100 μL蒸餾水，置于37℃水浴保溫10min；加入100μL試劑四，蓋緊后搖勻1min；加入20μL粗酶液，混勻后8000g 4℃離心10分鐘取上清；在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL，再加入40μL試劑二，120μL試劑五，20μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于580 nm測光吸收，記為A空白管。

6. 測定管：取 EP管，加入20μL粗酶液，100μL試劑三，置于37℃水浴保溫10min；加入100μL試劑四，

蓋緊后搖勻1min；8000g 4℃離心10分鐘取上清；在微量玻璃比色皿/96孔板加入上清液20μL，再加入40μL試劑二，120μL試劑五，20μL試劑六，混勻后室溫靜置20min，于 580 nm測光吸收，記為A測定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次。

計(jì)算公式：

a.使用微量玻璃比色皿測定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T

=27500×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃每克組織每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/g 鮮重）= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T

=27500×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.5 μmol/mL酪氨酸；稀釋倍數(shù)：（20+100+100）÷20=11；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10^-2mL；W：組織質(zhì)量（g）；V2：粗酶液總體積（mL），1mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），10min。

b.使用96孔板測定的計(jì)算公式如下

（（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃每毫克蛋白每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/mg prot）= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T

=27500×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃每克組織每分鐘催化血紅蛋白水解生成1nmol酪氨酸為1個(gè)酶活單位。

胃蛋白酶活性（nmol/min/g 鮮重）= C標(biāo)準(zhǔn)品×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T

=27500×（A測定管－A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管）÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，0.5 μmol/mL酪氨酸；稀釋倍數(shù)：（20+100+100）÷20=11；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10^-2mL；W：組織質(zhì)量（g）；V2：粗酶液總體積（mL），1mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），10min。

注意事項(xiàng)

試劑三、試劑四、試劑五臨用前配制，配制好用不完的試劑4℃可保存一周。