羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                      微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

HYP是機(jī)體膠原蛋白主要成分之一，膠原蛋白大多分布于皮膚、腱、軟骨和血管等，因此HYP含量是反映膠原組織代謝及纖維化程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

測(cè)定原理：

樣品經(jīng)水解產(chǎn)生游離的HYP，進(jìn)一步被氯胺T氧化，氧化產(chǎn)物與對(duì)二甲氨基苯j(luò)ia醛反應(yīng)，產(chǎn)生紅色化合物，在560nm處有特征吸收峰。通過(guò)測(cè)定樣品水解液560nm吸光值，可計(jì)算HYP含量。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、烘箱、玻璃管、離心機(jī)、水浴鍋、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、無(wú)水乙醇、異丙醇、6mol/L鹽酸和蒸餾水。

試劑組成和配制：

組織提取液：6mol/L鹽酸，自備。濃鹽酸：H₂O（V/V）= 1:1，室溫保存。

細(xì)胞提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體6mL×1瓶，4℃避光保存。

羥脯氨酸提取：

1.        組織：稱取約0.2g樣品于玻璃管，加入2mL的組織提取液，置于110℃烘箱，水解6至12小時(shí)，用提取液定容至2mL，12000g，25℃，離心20min，取上清待測(cè)。

2.        細(xì)胞：取約500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，加入1mL的細(xì)胞提取液，于高壓消毒器中15磅保持30min，自然降壓后待測(cè)。

3.        血清游離羥脯氨酸提取：取0.1mL血清，加入0.5mL無(wú)水乙醇使蛋白質(zhì)沉淀，8000g4℃離心5min。將上清倒入另一個(gè)EP管，氮吹或沸水浴將乙醇揮發(fā)干。冷卻后再加入0.2mL50%異丙醇，充分溶解混勻待測(cè)。

測(cè)定操作表：

1、   分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至560nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   操作表

羥脯氨酸含量計(jì)算公式：

a.        用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=64.875x+ 0.0251，R²=0.9991

（1）按樣品重量計(jì)算

組織羥脯氨酸含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷(V樣÷V樣總×W)

                        = 0.154×（ΔA-0.0251）÷W

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

細(xì)胞羥脯氨酸含量（mg/10⁴ cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（3）按血清體積計(jì)算

HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V反總÷V樣×2

                 =0.154×（ΔA-0.0251）

V反總：反應(yīng)總體積，0.3 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.06mL；V樣總：加入提取液體積， mL；W：樣本重量，g

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=32.4375x+ 0.0251，R²=0.9991

（1）按樣品重量計(jì)算

HYP含量（mg/g 鮮重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷(V樣÷V樣總×W)

                = 0.308×（ΔA-0.0251）÷W

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

HYP含量（mg/10⁴ cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）= 0.154×（ΔA-0.0251）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

（3）按血清體積計(jì)算

HYP含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V反總÷V樣×2

                 = 0.308×（ΔA-0.0251）

V反總：反應(yīng)總體積，0.3 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.06mL；V樣總：加入提取液體積， mL；W：樣本重量，g；2，血清吹干后復(fù)溶的倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1、   吸光值大于0.8，樣品適當(dāng)稀釋再測(cè)定，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)。

2、   試劑有一定的毒性，請(qǐng)操作時(shí)做好防護(hù)措施，防止吸入或與皮膚接觸。

3、   Z低檢出限為3.8mg/L。