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半胱氨酰亞砜裂解酶試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/3/30      點擊次數(shù):269

半胱氨酰亞砜裂解酶(L-cysteine sulfoxide lyase, CSL試劑盒說明書

  微量法100T/48S

   :正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義:

半胱氨酰亞砜裂解酶(CSL)廣泛存在于百合科蔥屬(如大蒜和洋蔥),十字花科蕓薹屬

(如卷心菜,菜花,西蘭花),以及豆科中的合金歡屬中,并通常被稱為蒜氨酸酶(Alliinase)。香菇酸在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和半胱氨酸亞砜裂解酶的作用下轉(zhuǎn)化成香菇精,以及產(chǎn)生丙酮酸、乙醛、甲醛和NH3CSL是內(nèi)源性甲醛生成的關(guān)鍵酶之一,測定CSL活性對于研究食品安全具有重要意義。

 

測定原理:

CSL催化S-甲基-L-半胱氨酸亞砜反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸,與2,4-er硝/基苯肼反應(yīng),在堿性條件下顯棕紅色,在510nm下有特征吸收峰。

 

自備實驗用品及儀器:

天平、研缽、離心機、酶標儀、96孔板、恒溫水浴鍋、蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:粉劑×1瓶,4℃避光保存,臨用前加入2mL水溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存;

試劑二:粉劑×1瓶,-20℃避光保存,臨用前加入10mL水溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存;

試劑三:液體15mL×1瓶,4℃保存。

試劑四:液體6mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑五:液體30mL×1瓶,4℃保存。

 

樣本處理:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿,4℃浸提40min12000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。           

 

測定操作:

 


對照管

測定管

樣品(μL

50

50

試劑一(μL


25

蒸餾水(μL

25


試劑二(μL

25

25

充分混勻,37℃反應(yīng)20min

試劑三(μL

100

100

試劑四(μL

50

50

充分混勻,室溫反應(yīng)5min

試劑五(μL

250

250

充分混勻,靜置5min,吸取200μL96孔板,測定510nm處吸光值,記為A對照和A測定,△A=A測定-A對照。每個測定管設(shè)一個對照管。

 

 

計算公式:

標準曲線:y = 0.7313x + 0.0027,R2 = 0.9993x為標準品濃度:μmol/mL;y為吸光度△A

1. 按蛋白含量計算

C-S lyase活性(μmol/min/mg prot=△A -0.0027÷ 0.7313×V÷(V×Cpr )÷T

                    =0.068×△A-0.0027÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計算

C-S lyase活性(μmol/min/g 鮮重)=△A -0.0027÷ 0.7313×V÷(V÷V樣總×W )÷T

                    =0.068×△A-0.0027÷ W

V樣,加入樣本上清體積,0.05mLV樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,gT,反應(yīng)時間,20min。

 

注意事項:

1.        若測定結(jié)果中吸光值超過1,請將樣本稀釋后進行測定,并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。香菇類樣本活性較大,可能需要稀釋80-100倍。


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