輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書

                                        微量法100管/48樣

注   意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，NAD⁺是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要氫受體，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時，形成大量的ROS，同時NADH再生為NAD⁺。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD⁺比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD⁺比值說明細胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD⁺比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD⁺降解產(chǎn)物對細胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達等具有重要的調(diào)控作用。

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD⁺和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在570nm下檢測吸光值；而NAD⁺可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用MTT還原法檢測。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺式離心機、移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

酸性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體3 mL×1瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶，-20 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1瓶，4 ℃保存，用時加入3mL蒸餾水，混勻，用不完的試劑4℃保存一周；

試劑五：液體3.6mL×1瓶，4 ℃保存；

試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。

NAD⁺和NADH的提取：

1 血清（漿）中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，

置冰上待測。

2組織中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3 細胞或細菌中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

NADH的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、   分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）：

充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

混勻，取200μL轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下讀取對照吸光值A1和測定管吸光值A2，計算△A=A2-A1。

注意事項：

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管

加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng)20min后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若NAD⁺測定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH測定中△A（A2-A1）≤0.0222，說明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：（1）將測定管避光靜置時間20min延長到60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取0.2g樣本或0.2mL樣本加入1mL提取液。

5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒100管保證測48個NAD⁺或NADH.

NAD⁺和NADH含量的計算：

（一）      NAD⁺含量的計算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1475x + 0.0302，R² = 0.9978；其中y為△A，x為NAD⁺濃度nmol/mL

1、血清（漿）中NAD⁺含量計算

NAD⁺含量(nmol/mL）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302）

2、組織、細菌或細胞中NAD⁺含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NAD⁺ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302）÷W

 (3)按細菌或細胞密度計算

NAD⁺ (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）

（二）NADH含量的計算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1404x + 0.0222，R² = 0.9976；其中y為△A，x為NADH濃度nmol/mL

1、血清（漿）中NADH含量計算

NADH含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）

2、組織、細菌或細胞中NADH含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222）÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

NADH (nmol/10⁴ cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222）

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬。

注 意：最di檢測限為0.1nmol/mL或0.1nmol/g鮮重 或0.001nmol/mg prot