偽狂犬病毒通用型(PRV-gH)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
通用名稱:偽狂犬病毒通用型(PRV-gH)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)
Name :Pseudorabies Virus gH gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒
偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型、傳染性延髓麻痹病毒、奇癢癥病毒、奧葉茲基氏病病毒。是引起牛、羊、豬、犬和貓等多種家畜和野生動物發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒[1]。豬是偽狂犬病的唯-一自然宿主,對其危害大??芍氯焉锬肛i流產(chǎn),產(chǎn)死胎及胎兒干尸化。對初生仔豬則引起神經(jīng)癥狀,出現(xiàn)運(yùn)動失調(diào),麻痹,衰竭死亡,病死率 100%。成年豬多呈隱性感染,但可引起呼吸道癥狀[2]。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源,病毒主要從病豬的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除,有的帶毒豬可持續(xù)排毒一年。
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 原理,檢測偽狂犬病毒,對偽狂犬病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的診斷及療效評
估有重要指導(dǎo)意義。
本試劑盒采用 TaqMan 探針法實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù),設(shè)計(jì)一對偽狂犬病病毒通用型特異性引物,結(jié)合一條特異性探針,用熒光 PCR 技術(shù)對偽狂犬病病毒通用型的 DNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。
包裝規(guī)格 | 50T/盒 |
PRV-gH 反應(yīng)液 | 500μL×2 管 |
酶液 | 50μL×1 管 |
PRV-gH 陽性質(zhì)控品 | 50μL ×1 管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL ×1 管 |
說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個(gè)月。
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。
病死或撲殺的豬,取腦、淋巴結(jié)、脾臟、肺臟等組織;待檢活豬,用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等, 置于 50%甘油生理鹽水中,或用注射器取血 5mL。
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸, 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
1. 樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1 樣本前處理
組織樣品:每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0. 5g 于研磨器中研磨,加入
1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;分泌物棉拭子直接取 100μL 提??;血液取血清 100μL 提取。
推薦采用優(yōu)利科(上海)生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進(jìn)行核酸提取,請按照 試劑說明書進(jìn)行操作。
根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),單個(gè)測試反應(yīng)液體系配制如下表:
試劑 | PRV-gH 反應(yīng)液 | 酶液 |
用量(樣本數(shù)為 N) | 20μL | 1μL |
將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21μL/管。
將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;
熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇
ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。
陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;
可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38,且曲線有明顯的增長曲線, 判定為陽性,否則為陰性;
陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。
陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32;以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
3. 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;
4. 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
5. 不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
6. 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;
7. 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
1. 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;
2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,*混勻并短暫離心;
3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;
4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;
6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;
7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
[1] 婁高明,杜偉賢.偽狂犬病流行概況及豬場防制策略[J].中國動物檢疫,1999,16(5):43-45.
[2] 殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1997.
[3] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 35911-2018 偽狂犬病病毒熒光 PCR 檢測方法.[S].
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